第一節(jié)　病原體耐藥性檢測

一、藥物敏感試驗(yàn)：藥物敏感試驗(yàn)簡稱藥敏試驗(yàn)（或耐藥試驗(yàn)）。旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導(dǎo)臨床合理選用抗生素藥物的微生物學(xué)試驗(yàn)。

1、藥敏試驗(yàn)的意義：一種抗生素如果以很小的劑量便可抑制、殺滅致病菌，則稱該種致病菌對該抗生素“敏感”。反之，則稱為“不敏感”或“耐藥”。為了解致病菌對哪種抗菌素敏感，以合理用藥，減少盲目性，往往應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。其大致方法是：從病人的感染部位采取含致病菌的標(biāo)本，接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，于一定條件下培養(yǎng)；同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養(yǎng)基表面（或用不銹鋼圈，內(nèi)放定量抗生素溶液），培養(yǎng)一定時間后觀察結(jié)果。由于致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現(xiàn)不同大小的抑制病菌生長而形成的“空圈”，稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關(guān)系。于是可以根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果有針對性地選用抗生素。

2、藥物敏感試驗(yàn)的方法：目前常用的藥敏試驗(yàn)方法有：紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）、稀釋法、E試驗(yàn)、檢測細(xì)菌耐藥性的方法。稀釋法分液體稀釋法和瓊脂稀釋法。檢測細(xì)菌耐藥性的方法包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測、耐萬古霉素腸球菌（VER）的檢測、耐青霉素肺炎鏈球菌（PRP）的檢測、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）的檢測和β-內(nèi)酰胺酶的檢測。

二、耐藥菌檢測試驗(yàn)：

（一）細(xì)菌耐藥表型檢測：判斷細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性可根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，通過測量紙片擴(kuò)散法、肉湯稀釋法和E試驗(yàn)的抑菌圈直徑、MIC值和IC值獲得。也可通過以下方法進(jìn)行檢測：

1、耐藥篩選試驗(yàn)：以單一藥物的單一濃度檢測細(xì)菌的耐藥性被稱為耐藥篩選試驗(yàn)，臨床上常用于篩選耐甲氧西林葡萄球菌、萬古霉素中介的葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌及氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌等。

2、折點(diǎn)敏感試驗(yàn)：僅用特定的抗菌藥物濃度（敏感、中介或耐藥折點(diǎn)MIC），而不使用測定MIC時所用的系列對倍稀釋抗生素濃度測試細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，稱為折點(diǎn)敏感試驗(yàn)。

3、雙紙片協(xié)同試驗(yàn)：雙紙片協(xié)同試驗(yàn)是主要用于篩選產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）革蘭陰性桿菌的紙片瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。若指示藥敏紙片在朝向阿莫西林/克拉維酸方向有抑菌圈擴(kuò)大現(xiàn)象（協(xié)同），說明測試菌產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

4、藥敏試驗(yàn)的儀器化和自動化：全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等運(yùn)用折點(diǎn)敏感試驗(yàn)的原理可半定量測定抗菌藥物的MIC值。

（二）β-內(nèi)酰胺酶檢測：主要有碘淀粉測定法和頭孢硝噻吩紙片法。臨床常用頭孢硝噻吩紙片法，β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)可快速檢測流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和腸球菌對青霉素的耐藥性。如β-內(nèi)酰胺酶陽性，表示上述細(xì)菌對青霉素、氨芐西林、阿莫西林耐藥；表示葡萄球菌和腸球菌對青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐藥。

（三）耐藥基因檢測：臨床可檢測的耐藥基因主要有：葡萄球菌與甲氧西林耐藥有關(guān)的MecA基因,大腸埃希菌與β-內(nèi)酰胺類耐藥有關(guān)的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，腸球菌與萬古霉素耐藥有關(guān)的vanA、vanB、vanC、vanD基因。檢測抗菌藥物耐藥基因的方法主要有：PCR擴(kuò)增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-線性探針分析、生物芯片技術(shù) 、自動DNA測序

（四）特殊耐藥菌檢測：

1、耐甲氧西林葡萄球菌檢測：對 1цg苯唑西林紙片的抑菌圈直徑≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黃色葡萄球菌和對1цg苯唑西林紙片的抑菌圈直徑≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml的凝固酶陰性葡萄球菌被稱為耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。對MRS不論其體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果，所有的β-內(nèi)酰胺類藥物和β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均顯示臨床無效；絕大多數(shù)的MRS常為多重耐藥，耐藥范圍包括氨基糖甙類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等。

2、耐青霉素肺炎鏈球菌檢測：當(dāng)對1цg苯唑西林紙片抑菌圈直徑〈20㎜或MIC〉0.06цg/ml均應(yīng)視為耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）。臨床治療顯示 PRSP對氨卞西林、氨卞西林/舒巴坦、頭胞克肟、頭胞唑肟，臨床治療療效很差，但應(yīng)檢測對頭胞曲松、頭胞噻肟和美洛培南等的MIC以判斷是否對這些抗生素敏感。

3、耐萬古霉素腸球菌檢測：腸球菌對30цg萬古霉素紙片抑菌圈直徑≤14㎜或MIC≥32цg/ml被稱為耐萬古霉素腸球菌（VRE）。針對多重萬古霉素藥物目前尚無有效治療方法，但對青霉素敏感的VRE可用青霉素和慶大霉素聯(lián)合治療，若對青霉素耐藥而不是高水平耐氨基糖甙類可用壁霉素+慶大霉素。

4、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科細(xì)菌檢測： 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是一種能水解青霉素、廣譜頭孢菌素及單胺類的酶，主要由克雷伯菌、腸桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生。當(dāng)通過篩選法時對頭孢泊肟、頭孢他啶（10цg/片）抑菌圈≤22㎜或氨曲南、頭孢噻肟（30цg/片）≤27㎜的菌株經(jīng)頭孢他啶（30цg/片）、頭孢他啶/克拉維酸（30/10цg）；頭孢噻肟（30цg/片）、頭孢噻肟/克拉維酸（30/10цg）兩組表型確證試驗(yàn)，其結(jié)果為兩組中任何一組藥物加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈相比，增大值≥5㎜時判斷為產(chǎn)ESBL菌株（圖7-13）。產(chǎn)ESBL克雷伯菌和大腸埃希菌不論其體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果如何，對青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無效。